2.3 巨噬细胞对野生型酵母孢子的巨噬酵母吞噬不依赖于血清调理

为了探究巨噬细胞对酵母孢子识别是否依赖于血清中补体或抗体成分，检测无血清培养基对吞噬野生型孢子效率的细胞影响。如图3(a)所示，识别每100个巨噬细胞于有、酿酒无血清情况下吞噬营养态酵母和野生型酵母孢子的研究个数分别为42、38和338、巨噬酵母322，细胞统计分析无显著性差异，识别这表明巨噬细胞对营养态酵母或野生型酵母孢子的酿酒吞噬不依赖于血清中补体和免疫球蛋白成分。图3(b)显示，研究无血清条件下摄入营养态酵母或野生型孢子的巨噬酵母巨噬细胞占总细胞的比率分别为18％和83％，这表明巨噬细胞对野生型孢子有更高效的细胞内吞作用。因此，识别巨噬细胞对野生型孢子的酿酒吞噬不是依赖于血清中补体和抗体调理导致的间接吞噬.这种吞噬极有可能是孢子表面存在的物质被巨噬细胞识别从而引起吞噬。

2.4 巨噬细胞吞噬酵母孢子的研究配体为共价结合到孢子壁的非蛋白质成分

为了进一步探究孢子壁上何种物质作为分子配体导致野生型酵母孢子的高效吞噬，通过高盐洗涤除去吸附在野生型酵母孢子壁上的分子，利用蛋白酶处理孢子壁并比较其吞噬效率。如图4所示，处理后的酵母孢子吞噬效率与对照组吞噬效率无显著差异，这表明野生型孢子表面被巨噬细胞识别的主要配体不是吸附于二酪氨酸层的物质。而是共价结合到二酪氨酸层的物质，并且这种分子配体物质不是蛋白质。

2.5 巨噬细胞吞噬营养态酵母依赖于葡聚糖配体，而酵母孢子不依赖

微生物表面的糖链能够被巨噬细胞所识别，从而引起吞噬俐。为了探究巨噬细胞吞噬营养态酵母和野生型酵母孢子与糖链配体是否有关，通过一系列糖链作为配体竞争抑制剂。昆布糖(直链的葡聚糖)能够抑制由于酵母葡聚糖配体引起的吞噬，因此选取昆布糖作为对照组。从图5可知。昆布糖能够显著地抑制巨噬细胞对营养态酵母和葡聚糖微球的吞噬，但对野生型酵母孢子的吞噬无显著影响。图5表明，甘露糖、甘露聚糖、半乳糖、乳糖以及岩藻糖对营养态酵母以及野生型酵母孢子的吞噬均无显著影响。因此巨噬细胞通过识别营养态酵母和葡聚糖微球上葡聚糖配体介导吞噬，但野生型酵母孢子表面被巨噬细胞识别的配体不是葡聚糖或甘露聚糖等糖链，巨噬细胞识别营养态酵母和野生型酵母孢子的配体不同。

2.6 巨噬细胞对野生型酵母孢子的识别依赖于二酪氨酸层结构

为了探究野生型孢子表面被识别的配体，比较巨噬细胞吞噬野生型酵母孢子(AN12D孢子)、dit1△孢子和shs3△孢子的效率。Dit1△菌株是野生型酵母敲除二酪氨酸层合成基因DITI后得到的菌株，因此dit1△孢子无二酪氨酸层。Chs3△菌株是野生型酵母敲除酵母孢子壳聚糖层合成基因CHS3后得到的菌株，因此chs3△孢子无壳聚糖层。由于二酪氨酸层的合成是依赖于壳聚糖层的存在，因此chs3△孢子也无二酪氨酸层的存在。统计每100个巨噬细胞吞噬野生型酵母孢子、dit1△孢子和chs3△孢子的个数，从图6可知，巨噬细胞对野生型酵母孢子的吞噬效率显著高于dit1△孢子和chs3△孢子。如图6(b)所示。酵母dit1△孢子和chs3△孢子与野生型酵母孢子大小相似，但巨噬细胞对野生型孢子的吞噬更为高效，这表明巨噬细胞对野生型酵母孢子的高效吞噬不是因为其直径小于营养态酵母，而是因为野生型酵母孢子壁最外层二酪氨酸层的存在使其能被巨噬细胞识别，从而介导吞噬的发生。
 

3 结语

酿酒酵母孢子形态对免疫细胞的作用未被详细研究，作者通过比较巨噬细胞对营养态酵母和野生型酵母孢子的内吞效率，发现野生型酵母孢子能够更高效地被巨噬细胞内吞。进一步研究表明：野生型酵母孢子和营养态酵母的内吞是依赖于Svk的受体介导的吞噬作用，但野生型酵母孢子的吞噬相对于营养态酵母而言极其依赖P13K，这表明巨噬细胞吞噬野生型孢子和营养态酵母的吞噬信号途径也有所不同。营养态酵母的吞噬配体是葡聚糖，但野生型酵母孢子的吞噬不依赖于葡聚糖配体，其高效吞噬与野生型孢子壁二酪氨酸层有关。

本研究表明，巨噬细胞高效吞噬野生型酵母孢子是依赖于二酪氨酸层，对这种配体的分子研究让我们能够找到一种可利用的、作为载体的生物分子配体，可将外源物质高效传递到巨噬细胞体内，为日后开发一种无毒、高效的靶向巨噬细胞的生物介质提供理论依据。

相关链接：酪氨酸，葡聚糖，壳聚糖，甘露糖

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